免疫印迹技术 _生活经验

文章插图
免疫印迹法是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。
对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测，具有分析容量大、敏感度高、特异性强等优点，是检测蛋白质特性、表达与分布的一种最常用的方法，如组织抗原的定性定量检测、多肽分子的质量测定及病毒的抗体或抗原检测等。
【免疫印迹技术】

检查部位：其他
科室：体检保健科
空腹检查：否
禁忌人群：
参考价格：

免疫印迹技术——检查细节、注意事项、步骤、结果解读
免疫印迹技术——检查项目的不适宜人群：
暂无内容免疫印迹技术——检查项目的注意细节：
不适宜人群：无
检查时禁忌：无
检查时禁忌：
1.一抗、二抗的稀释度、作用时间和温度对不同的蛋白要经过预实验确定最佳条件。
2.显色液必须新鲜配置使用，最后加入H2O2 。
3.DAB有致癌的潜在可能，操作时要小心仔细。
免疫印迹技术——检查项目的一般步骤：
(一)蛋白质样品获得：细菌诱导表达后，可通过电泳上样缓冲液直接裂解细胞，真核细胞加匀浆缓冲液，机械或超声波室温匀浆0.5-1min 。然后4℃，13，000g离心15min 。取上清液作为样品。
(二)电泳：制备电泳凝胶，进行SDS-PAGE 。
(三)转移：(半干式转移)
1.电泳结束后将胶条割至合适大?。米せ撼逡浩胶猓?5min×3次。
2.膜处理：预先裁好与胶条同样大小的滤纸和NC膜，浸入转膜缓冲液中10min 。
3.转膜：转膜装置从下至上依次按阳极碳板、24层滤纸、NC膜、凝胶、24层滤纸、阴极碳板的顺序放好，滤纸、凝胶、NC膜精确对齐，每一步去除气泡，上压500g重物，将碳板上多余的液体吸干。接通电源，恒流1mA/cm2 ，转移1.5hr 。转移结束后，断开电源将膜取出，割取待测膜条做免疫印迹。将有蛋白标准的条带染色，放入膜染色液中50s后，在50%甲醇中多次脱色，至背景清晰，然后用双蒸水洗，风干夹于两层滤纸中保存，留与显色结果作对比。
(四)免疫反应：
1.用0.01MPBS洗膜，5min×3次。
2.加入包被液，平稳摇动，室温2hr 。
3.弃包被液，用0.01MPBS洗膜，5min×3次。
4.加入一抗(按合适稀释比例用0.01MPBS稀释，液体必须覆盖膜的全部)，4℃放置12hr以上。阴性对照，以1%BSA取代一抗，其余步骤与实验组相同。
5.弃一抗和1%BSA ，用0.01MPBS分别洗膜，5min×4次。
6.加入辣根过氧化物酶偶联的二抗(按合适稀释比例用0.01MPBS稀释) ，平稳摇动，室温2hr 。
7.弃二抗，用0.01MPBS洗膜，5min×4次。
8.加入显色液，避光显色至出现条带时放入双蒸水中终止反应。
免疫印迹技术——检查项目结果解读：
(一)蛋白质样品获得：细菌诱导表达后，可通过电泳上样缓冲液直接裂解细胞，真核细胞加匀浆缓冲液，机械或超声波室温匀浆0.5-1min 。然后4℃，13 ， 000g离心15min 。取上清液作为样品。
(二)电泳：制备电泳凝胶，进行SDS-PAGE 。
(三)转移：(半干式转移)
1.电泳结束后将胶条割至合适大小，用转膜缓冲液平衡， 5min×3次。
2.膜处理：预先裁好与胶条同样大小的滤纸和NC膜，浸入转膜缓冲液中10min 。
3.转膜：转膜装置从下至上依次按阳极碳板、24层滤纸、NC膜、凝胶、24层滤纸、阴极碳板的顺序放好，滤纸、凝胶、NC膜精确对齐，每一步去除气泡，上压500g重物，将碳板上多余的液体吸干。接通电源，恒流1mA/cm2，转移1.5hr 。转移结束后，断开电源将膜取出，割取待测膜条做免疫印迹。将有蛋白标准的条带染色，放入膜染色液中50s后，在50%甲醇中多次脱色，至背景清晰，然后用双蒸水洗，风干夹于两层滤纸中保存，留与显色结果作对比。
(四)免疫反应：
1.用0.01MPBS洗膜，5min×3次。
2.加入包被液，平稳摇动，室温2hr 。
3.弃包被液，用0.01MPBS洗膜，5min×3次。
4.加入一抗(按合适稀释比例用0.01MPBS稀释，液体必须覆盖膜的全部)，4℃放置12hr以上。阴性对照，以1%BSA取代一抗，其余步骤与实验组相同。
5.弃一抗和1%BSA，用0.01MPBS分别洗膜，5min×4次。
6.加入辣根过氧化物酶偶联的二抗(按合适稀释比例用0.01MPBS稀释)，平稳摇动，室温2hr 。
7.弃二抗，用0.01MPBS洗膜， 5min×4次。
8.加入显色液，避光显色至出现条带时放入双蒸水中终止反应。

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