逆转录-聚合酶链反应RT-PCR _生活经验

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逆转录-聚合酶链反应 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)的原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA 。
再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。

检查部位：其他
科室：免疫学检验,血
空腹检查：否
禁忌人群：
参考价格：

逆转录-聚合酶链反应RT-PCR——检查细节、注意事项、步骤、结果解读
逆转录-聚合酶链反应RT-PCR——检查项目的不适宜人群：
暂无内容逆转录-聚合酶链反应RT-PCR——检查项目的注意细节：
1.在实验过程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。在总RNA的提取过程中，注意避免mRNA的断裂。
2.为了防止非特异性扩增，必须设阴性对照。
3.内参的设定：主要为了用于靶RNA的定量。常用的内参有G3PD（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）、β-Actin（β-肌动蛋白）等。其目的在于避免RNA定量误差、加样误差以及各PCR反应体系中扩增效率不均一各孔间的温度差等所造成的误差。
4.PCR不能进入平台期，出现平台效应与所扩增的目的基因的长度、序列、二级结构以及目标DNA起始的数量有关。故对于每一个目标序列出现平台效应的循环数，均应通过单独实验来确定。
5.防止DNA的污染：
（1)采用DNA酶处理RNA样品。
（2）在可能的情况下，将PCR引物置于基因的不同外显子，以消除基因和mRNA的共线性。
逆转录-聚合酶链反应RT-PCR——检查项目的一般步骤：
1.总RNA的提?。杭喙啬谌?。
2.cDNA第一链的合成：目前试剂公司有多种cDNA第一链试剂盒出售，其原理基本相同，但操作步骤不一。现以GIBICOL公司提供的SuperScriptPreamplificationSystemforFirstStrandcDNASynthesis试剂盒为例。
（1）在0.5ml微量离心管中，加入总RNA1-5μg ，补充适量的DEPCH2O使总体积达11μl 。在管中加10μMOligo（dT）12-181μl，轻轻混匀、离心。
（2）70℃加热10min ，立即将微量离心管插入冰浴中至少1min 。
然后加入下列试剂的混合物：
【逆转录-聚合酶链反应RT-PCR】10×PCRbuffer2μl
25mMMgCl22μl
10mMdNTPmix1μl
0.1MDTT2μl
轻轻混匀，离心。42℃孵育2-5min 。
（3）加入SuperscriptⅡ1μl ，在42℃水浴中孵育50min 。
（4）于70℃加热15min以终止反应。
（5）将管插入冰中，加入RNaseH1μl，37℃孵育20min，降解残留的RNA 。-20℃保存备用。
3．PCR：
（1）取0.5mlPCR管，依次加入下列试剂：
第一链cDNA2μl
上游引物（10pM）2μl
下游引物（10pM）2μl
dNTP(2mM)4μl
10×PCRbuffer5μl
Taq酶（2u/μl）1μl
（2）加入适量的ddH2O ，使总体积达50μl 。轻轻混匀，离心。
（3）设定PCR程序。在适当的温度参数下扩增28-32个循环。为了保证实验结果的可靠与准确，可在PCR扩增目的基因时，加入一对内参（如G3PD）的特异性引物，同时扩增内参DNA，作为对照。
（4）电泳鉴定：行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。
（5）密度扫描、结果分析：采用凝胶图像分析系统，对电泳条带进行密度扫描。
逆转录-聚合酶链反应RT-PCR——检查项目结果解读：
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